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新型冠狀病毒消毒效果實驗室評價標準
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  • 2021-02-20
新型冠狀病毒消毒效果實驗室評價標準


1 范圍
本文件規定了消毒因子對新型冠狀病毒消毒效果實驗室評價的基本要求、病毒滅活試驗方法、結果評價和注意事項。
本文件適用于新型冠狀病毒實驗室消毒效果的檢測與評價。

2 規范性引用文件
下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。消毒技術規范（2002年版）衛生部 (衛法監發〔2002〕282號)

3 術語和定義
下列術語和定義適用于本文件。
3.1
低溫消毒 cryogenic disinfection
對溫度在0℃以下的環境或物品進行的消毒。低溫消毒需使用在該溫度下被證明有效的消毒因子。

4 基本要求
4.1
實驗室及人員要求
新型冠狀病毒消毒效果試驗應在獲得開展新型冠狀病毒培養實驗活動資格的BSL-3實驗室中進行；從事新型冠狀病毒消毒效果評價的實驗室人員應同時具有病毒學和消毒學實驗室工作經驗；進入BSL-3實驗室的人員應經過生物安全的培訓和考核，具有BSL-3實驗室的準入資格。
4.2
試驗要求
4.2.1
實驗室試驗分懸液法病毒滅活試驗和載體法病毒滅活試驗。實驗室試驗以懸液法病毒滅活試驗為主，對不適宜用懸液法病毒滅活試驗評價的消毒劑和器械，如黏稠的消毒劑、原液使用的消毒劑及紫外線等消毒器械的實驗室試驗可用載體法病毒滅活試驗。
4.2.2
實驗室懸液病毒滅活試驗時，有機干擾物為牛血清白蛋白。原則上對用于不經過清洗或污染的消毒對象的消毒劑，牛血清白蛋白的濃度為 3.0%；對用于經過清洗或較清潔的消毒對象的消毒劑，牛血清白蛋白的濃度為 0.3%；對用于經過嚴格清洗或極清潔的消毒對象的消毒劑，可不使用有機干擾物。試驗中病毒接觸的溶液、病毒載體等，均應在試驗溫度（20 ℃±1 ℃）平衡后開始試驗。實驗室載體病毒滅活試驗時使用相應滴度的病毒培養液滴染載體后備用。
4.2.3
用于評估消毒因子低溫消毒效果時，應做規定低溫條件下的消毒效果驗證，一般采用載體法進行。試驗時消毒劑和病毒載體應在低溫環境下平衡不少于 30 min 后進行測試，其余實驗步驟與常溫下（20 ℃±1 ℃）相同。
4.2.4
試驗重復 3 次，重復性試驗應分期分批進行。必要的器材和試劑應重新制備或滅菌，以防產生系統性誤差。

5 病毒滅活試驗方法
5.1
試驗器材
5.1.1
試驗病毒與細胞
試驗病毒為分裝保存并確定病毒滴度的新型冠狀病毒培養物，細胞株為非洲綠猴腎傳代細胞（Vero-E6）或其它適合用于新型冠狀病毒增殖培養的細胞系。
5.1.2
有機干擾物
牛血清白蛋白。
5.1.3
試劑
消毒因子、中和劑、細胞消化液、細胞維持液和細胞培養液等。
5.1.4
儀器
二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡、冰箱、水浴箱、II 級或 II 級以上生物安全柜等。
5.1.5
耗材
無菌帶濾芯tip頭、吸管、離心管、凍存管、試管、多孔細胞培養板、單道移液器、多道移液器等。
5.1.6
載體
可選用布片、玻璃片、不銹鋼片等。
5.2
細胞準備
實驗所用Vero- E6細胞或其它細胞在細胞培養室常規傳代培養，置二氧化碳培養箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養至單層細胞備用。
5.3
病毒懸液的制備
取出-80 ℃低溫保存的新型冠狀病毒，室溫解凍后，與設定濃度的有機干擾物混合作為消毒劑滅活試驗用病毒懸液。
5.4
載體的制備
5.4.1
載體應根據消毒對象選擇相應的材料。常用的材料有布片、玻璃片、不銹鋼片等，金屬載體一般用 12 mm 直徑圓形金屬片（厚 0.5 mm），其他材質載體一般為方形，大小 10 mm×10 mm，特定用途的消毒因子可使用其他相兼容材質的載體。
5.4.2
所用載體于染病毒前，應進行脫脂處理。脫脂過程應嚴格按照如下步驟進行：
a)
將載體放入含洗滌劑的水中煮沸 30 min;
b)
用自來水漂洗；
c)
用蒸餾水煮沸 10 min；
d)
用蒸餾水漂洗至 pH 呈中性；
e)
晾干，備用。
5.4.3
載體經壓力蒸汽滅菌后烘干備用，試驗前使用滴染法染病毒懸液。
5.4.4
滴染載體的病毒滴度對數值應≥4.0。
5.5
中和劑鑒定試驗
5.5.1
設計原則
鑒定試驗旨在確定所選中和劑是否適用于擬進行的細胞感染法病毒滅活試驗。中和劑鑒定試驗包括預試驗和正式試驗，通過預試驗確定消毒劑、中和產物和中和劑等對細胞生長有無影響；通過所設各組試驗結果綜合分析，確定所用中和劑是否對測試消毒劑有良好的中和作用，對試驗用病毒和細胞株是否有害或不良影響；中和試驗用消毒劑濃度應為正式消毒試驗最高濃度，作用時間最短不得少于30 s。試驗重復3次。
5.5.2
試驗分組
5.5.2.1
預試驗分組
在使用細胞感染法進行病毒滅活試驗時，對所用中和劑的鑒定，應進行以下各組預試驗，如果中和劑與中和產物對細胞生長無影響，再進行正式試驗。
a)
中和劑+細胞→培養：觀察所用中和劑對細胞的生長有無影響。
b)
（消毒劑+中和劑）+細胞→培養：觀察中和產物溶液對細胞生長有無影響。
c)
消毒劑+細胞→培養：觀察消毒劑對細胞生長有無影響。
在確定了中和劑與中和產物對細胞生長無影響后，進行正式試驗。
5.5.2.2
正式試驗分組
a)
中和劑+病毒懸液/病毒載體→接種細胞培養：觀察中和劑對病毒有無抑制作用。
b)
（消毒劑/消毒劑載體+中和劑）+病毒懸液/病毒載體→接種細胞培養：觀察中和產物，或未被完全中和的殘留消毒劑對病毒有無抑制作用或對檢測方法有無干擾。
c)
病毒懸液/病毒載體→接種細胞培養：觀察病毒是否可致細胞病變，并將該組病毒滴度對數值作為陽性對照值。
d)
未接種病毒的細胞→培養：觀察細胞生長是否正常。
5.5.3
操作步驟
5.5.3.1
懸液法中和劑鑒定試驗
a)
第 1 組。試驗體系中按病毒與中和劑（1︰4 體積比例）進行試驗。吸取 0.2 mL 病毒混懸液于試管內，置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，吸取中和劑溶液 0.8 mL，混合均勻。作用 10 min，以細胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養板上，每個滴度接種 4孔。置二氧化碳培養箱（36 ℃±1 ℃,5%±1% 二氧化碳）中培養 3-4 天。
b)
第 2 組。試驗體系中按病毒與中和產物（1︰4 體積比例）進行試驗。吸取 0.2 mL 病毒混懸液于試管內，置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，吸取中和產物溶液 0.8 mL，混合均勻。作用 10 min，以細胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養板上，每個滴度接種4 孔。置二氧化碳培養箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養 3-4 天。
c)
第 3 組。試驗體系中按病毒與細胞維持液（1:4 體積比例）進行試驗。吸取 0.2 mL 病毒混懸液于試管內，置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，吸取細胞維持液 0.8 mL，混合均勻。作用 10 min，以細胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養板上，每個滴度接種4 孔。置二氧化碳培養箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養 3-4 天。
d)
第 4 組。將試驗用細胞，加細胞維持液后置二氧化碳培養箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養。
5.5.3.2
載體法中和劑鑒定試驗
a)
第 1 組。將病毒載體置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，浸入中和劑 1.0 mL，作用 10 min。充分洗脫，以細胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養板上，每個滴度接種 4 孔。置二氧化碳培養箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養 3-4 天。
b)
第 2 組。將病毒載體置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，浸入中和產物溶液(染有消毒劑的載體+中和劑,作用 10 min)1.0 mL，混合均勻。充分洗脫，以細胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100μL，接種于單層細胞培養板上，每個滴度接種 4 孔。置二氧化碳培養箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養 3-4 天。
c)
第 3 組。將病毒載體置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，浸入細胞維持液 1.0 mL，充分洗脫，以細胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養板上，每個滴度接種 4 孔。置二氧化碳培養箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養 3-4 天。
d)
第 4 組。將試驗用細胞，加細胞維持液后置二氧化碳培養箱（36 ℃±1 ℃,5%±1%二氧化碳）中培養。
5.5.3.3
結果判定
試驗結果符合以下全部條件，所測中和劑可判為合格:
a)
第 1、2、3 組病毒生長與原接種量相近；
b)
第 4 組細胞生長正常；
c)
中和劑和中和產物，在正式試驗的最高濃度下對細胞生長無影響；
d)
連續 3 次試驗取得合格評價。
5.6
病毒滅活試驗
5.6.1
試驗原理
用細胞感染法測定消毒因子作用前后（或對照組與實驗組）樣本中病毒的量。以細胞病變作為判斷指標，確定各組病毒的感染滴度，觀察消毒因子對新型冠狀病毒的滅活效果。
5.6.2
懸液法病毒滅活試驗
5.6.2.1
操作步驟
a)
取待測消毒劑，用滅菌硬水稀釋至所需濃度的 1.25 倍，于 20 ℃±1 ℃水浴中備用。
b)
病毒懸液的制備：取出-80 ℃低溫保存的新型冠狀病毒，室溫解凍后，與有機干擾物按照 1：1 比例混合作為消毒劑滅活試驗用病毒懸液。
c)
消毒試驗：取上述病毒懸液 1 份加入 4 份待檢消毒劑，立即混勻并記時。作用至規定時間，立即取出 0.1 mL，加入經鑒定合格的 0.9 mL 中和劑中混勻；或用經鑒定合格的除藥方法處理。
d)
對照組試驗：陽性對照組為病毒對照組，觀察病毒生長是否良好，病毒滴度是否達到試驗要求；陰性對照組用細胞維持液作為陰性對照，觀察有無污染，細胞生長是否良好。
e)
以上各組按照終點稀釋法分別進行病毒滴度測定。試驗重復 3 次。
f)
終點稀釋法：用細胞維持液對待滴定樣本做 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養板上，每個滴度接種 4 孔。在 36 ℃±1 ℃放置 1 h～2 h 后，取出培養板，更換細胞維持液。繼續放入二氧化碳培養箱中（36 ℃±1 ℃,5%±1% 二氧化碳）培養 3-4 天，顯微鏡下觀察細胞生長狀態，記錄細胞病變情況。
5.6.2.2
結果判定
試驗結果符合以下全部條件，可判為合格：
a)
陰性對照組細胞生長正常；
b)
陽性對照組病毒滴度對數值應≥5.0；
c)
消毒試驗組細胞無病變，與陰性對照組細胞生長情況一致。
5.6.3
載體法病毒滅活試驗
5.6.3.1
操作步驟
a)
取待測消毒劑，置于 20 ℃±1 ℃水浴中備用。
b)
病毒載體的制備：取滅菌載體片，滴染新型冠狀病毒晾干備用。
c)
消毒試驗：取病毒載體置于消毒因子，作用至規定的時間后取出放入經鑒定合格的中和劑或洗脫液 1.0 mL 中，作用 10 min,混勻洗脫。消毒器械載體布點應置于最難殺滅部位，具體方法參照《消毒技術規范》。
d)
對照組試驗：陽性對照組為病毒對照組，觀察病毒生長是否良好，病毒滴度是否達到試驗要求；陰性對照組用細胞維持液作為陰性對照，觀察有無污染，細胞生長是否良好。
e)
以上各組按照終點稀釋法分別進行病毒滴度測定。試驗重復 3 次。
f)
終點稀釋法：用細胞維持液對待滴定樣本做 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養板上，每個滴度接種 4 孔。在 36 ℃±1 ℃放置 1 h～2 h 后，取出培養板，更換細胞維持液。繼續二氧化碳培養箱中（36 ℃±1 ℃,5%±1% 二氧化碳）培養 3-4 天，顯微鏡下觀察細胞生長狀態，記錄細胞病變情況。
5.6.3.2
結果判定
試驗結果符合以下全部條件，可判為合格：
a)
陰性對照組細胞生長正常；
b)
陽性對照組病毒滴度對數值應≥4.0；
c)
消毒試驗組細胞無病變，與陰性對照組細胞生長情況一致。

6 結果評價
同時符合下列a)和b)的消毒因子判為消毒效果合格：
a)
去除殘留消毒劑效果的中和劑鑒定試驗合格；
b)
懸液滅活試驗，每次試驗對新型冠狀病毒應有效滅活，陽性對照組病毒滴度對數值應≥5.0 或載體滅活試驗，每次試驗對新型冠狀病毒應有效滅活，陽性對照組病毒滴度對數值應≥4.0。

7 注意事項
7.1
實驗人員應嚴格按照 BSL-3 實驗室個人防護標準操作規程要求做好個人防護。建議參與實驗的人員進行新型冠狀病毒疫苗接種。
7.2
涉及新型冠狀病毒活病毒的操作應嚴格執行 BSL-3 實驗室的生物安全相關規定。
7.3
無菌器材使用前需檢查包裝是否完整，有破損者不得使用。
7.4
消毒試驗所用的細胞培養基和試劑等均需無菌。
7.5
實驗活動涉及新型冠狀病毒活病毒的操作，應在 BSL-3 實驗室的生物安全柜中進行，實驗過程中若發生溢灑等意外情況時，應嚴格按照 BSL-3 實驗室意外情況應急處置操作規程等進行安全處置。
7.6
實驗廢棄物應按照相應廢棄物處置操作規程進行安全處置。